法氏囊活性五肽BP5的抗肿瘤作用（法氏囊的功能）

法氏囊(bursa of Fabricus,BF) 是具有与胸腺相同地位的体液中枢器官，是禽类特有的免疫器官。禽类前体B细胞从骨髓迁移到BF，并在BF中分化、发育为成熟的B细胞，然后通过淋巴循环和血液循环迁移到外周淋巴器官参与免疫反应^[]。已证实，BF组织中存在多种生物活性物质，囊素三肽 (bursin,BS) 是BF组织中第一个化学结构明确的生物活性因子 ^[]，此后，法氏囊生物活性肽引起了人们的广泛关注，近年来，有多条法氏囊活性肽从法氏囊组织中被分离鉴定^{[, , , ]}。

不少学者对法氏囊活性肽展开了广泛而深入的研究，先前的研究主要集中在体液免疫方面，近两年研究发现法氏囊活性肽对细胞免疫也具有调节作用，有些还具有抗肿瘤活性^{[, ]}。法氏囊活性五肽BP5 (Bursopentin) 是从鸡BF中分离到的一种新的免疫活性肽，不仅具有调节体液免疫和细胞免疫反应、抗氧化功能，还具有抗肿瘤活性^{[, , ]}。目前，BP5发挥抗肿瘤作用机制研究甚少，本研究通过T7噬菌体展示技术筛选BP5鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库相互作用蛋白，结合cDNA基因芯片技术检测BP5刺激鸡DT40细胞后抗肿瘤信号通路中重要的信号功能基因，并检测BP5对肿瘤细胞中p53 Luciferase活性和p53信号通路中相关蛋白表达的影响，进而从分子水平上为揭示BP5的抗肿瘤分子机制提供科学依据，同时为进一步明确BP5的生物学功能奠定基础。

鸡DT40细胞 (鸡B淋巴瘤细胞) 和HCT116细胞 (人结肠癌细胞) 购自广州吉妮欧生物科技有限公司；SV Total RNA Isolation System和PolyATtract^® mRNA Isolation System II with Magnetic Stand均购自Promega公司；T7 Select OrientExpress Random Primer cDNA Cloning Systems (包括T7 Select OrientExpress Random Primer cDNA Synthesis Kit、EcoR I/Hind III End Modification

Kit、DNA Ligation Kit、Mini Column Fractionation Kit 和T7 Select1-1 Cloning Kit)购自Novagen公司；Taq酶、100 bp DNA Marker、TRIzol试剂、One Step SYBR^® PrimeScript^® RT-PCR Kit均购自TaKaRa公司； T7 UP Primer、T7 DOWN Primer及实时荧光定量PCR引物均由华大基因科技股份有限公司合成。文库鉴定引物序列为：T7 UP Primer: 5′-GGAGCTGTCGTA TTCCAGTC-3′，T7 DOWN Primer: 5′-AACCCCTCA AGACCCGTTTA-3′。Dual-Luciferase^® Reporter (DLR^TM) Assay Kit购自Promega公司；Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；Doxorubicin (Dox) 和Camptothecin (CPT) 购自Sigma公司；鼠抗人p53 (DO-1)、鼠抗人CHEK2 (B-4)、鼠抗人CCNE1 (HE-12)、鼠抗人p21抗体 (F-5) 和兔抗人action (H-196) 均购自Santa Cruz公司。BP5和BP5-BSA由上海科肽生物有限公司合成，纯度95%以上。

1.2.1 鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA原始文库的构建：将鸡DT40细胞约3×10⁶ cells/mL按照SV Total RNA Isolation System和PolyATtract^® mRNA Isolation System II with Magnetic Stand操作手册，提取其总RNA并进行mRNA纯化。用紫外分光光度计测定鸡DT40细胞总RNA及mRNA的含量与纯度。双链cDNA的合成、末端修饰、EcoR I/Hind III接头连接、酶切及cDNA片段分离均按照OrientExpress^TM cDNA Manual进行，cDNA与T7噬菌体载体连接及体外包装则按照T7 Select1-1 Cloning Kit说明书进行，体外包装后的反应液即为鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA原始文库。

1.2.2 文库鉴定及文库扩增：按照T7 Select^® System Manual进行文库滴度测定及文库扩增，通过PCR扩增进行文库重组率鉴定。原始文库滴度(pfu/mL)=噬菌斑数×稀释度×10。根据原始文库滴度，采用固体平板裂解法进行文库扩增，取10 μL扩增后文库进行滴度测定，剩下的与1/10体积80%甘油混合后分装，于-70℃保存备用。随机挑取24个噬菌斑，取其裂解液进行PCR扩增。PCR反应体系为：噬菌体裂解液2 μL，T7 UP Primer 1 μL，T7 DOWN Primer 1 μL，dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，Taq Polymerase 1 μL，ddH₂O 39 μL。反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 50 s，50℃ 1 min，72℃ 1 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小，并计算文库重组率。

用BP5-BSA和BSA包被酶标板，参照T7 Select^® System Manual和三肽囊素特异性结合肽及筛选方法^[]，先进行BSA预筛选，再进行三轮亲和筛选，并进行滴度测定。随机挑取第三轮筛选后的噬菌体20个克隆，取其裂解液进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。大于250 bp的cDNA插入片断以T7 UP Primer为引物送至华大基因科技股份有限公司进行测序，同时对BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白进行生物信息学分析。

将鸡DT40细胞培养至约2×10⁶ cells/mL，加入2 μg/mL BP5刺激细胞4 h，以PBS组为空白对照组，诱导结束后离心收集细胞，并用PBS缓冲液快速洗1次，收集细胞，按照每5×10⁶ cells加1 mL TRIzol的比例加入TRIzol试剂，用移液器吸头反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，形成清亮不粘稠的液体，作为寄送的样品送至上海欧易生物医学科技有限公司，采用美国Affymetrix公司Affymetrix 3.0鸡表达谱芯片进行基因芯片分析，检测BP5刺激组和未刺激组鸡DT40细胞mRNA差异表达情况，获得BP5刺激鸡DT40细胞的差异基因表达谱，筛选Fold change≥2.0的差异表达基因。利用GO-analysis软件统计差异表达基因的显著性，分析差异基因的功能，并进行相关的Pathway分析。

根据BP5刺激鸡DT40细胞的差异基因表达谱的GO功能分析及Pathway分析结果，选取表达水平有明显变化的10个基因 (SIAH1、CHEK2、TP53、CCNE1、CIP1、CHUK、BIRC2、PRKX、CACNA2D2、NRK基因) 进行RT-PCR，以GAPDH基因为内参。将鸡DT40细胞培养至约2×10⁶ cells/mL，加入2 μg/mL BP5刺激细胞4 h，以PBS组为空白对照组，收集细胞并提取总RNA，按照One Step SYBR^® PrimeScript^® RT-PCR Kit说明书将总RNA反转录成cDNA，通过Roche Light Cycler 480进行RT-PCR检测。用Rotor-Gene软件进行Ct值分析，采用2^-ΔΔCt法分析待测基因表达水平。

按Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒说明书，将含有荧光素酶标记基因的p53-Luc质粒转染到HCT116细胞中，12 h后分别加入用不同浓度 (0.02-20 μg/mL) 的BP5，同时设立Dox和CPT阳性对照和PBS空白对照，于转染后24 h后收样，检测p53的相对Luciferase活性。另外，HCT116细胞转染24 h后，加入p53抑制剂20 μmol/L α-pifithrin作用2 h，然后用20 μg/mL BP5继续作用22 h，检测p53的相对Luciferase活性。

用BP5 (0.2-20 μg/mL) 刺激HCT116细胞，同时设PBS空白对照组和Dox和CPT阳性对照组，24 h后收集蛋白，利用鼠抗人p53、鼠抗人CCNE1、鼠抗人CHEK2、鼠抗人p21和兔抗人action抗体做Western blotting检测p53、p21、CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平，actin作为上样量的对照。

按试剂盒操作说明提取鸡DT40细胞的总RNA和mRNA，经分光光度计测定，总RNA的纯度为A₂₆₀/A₂₈₀=1.9，含量为656 μg；mRNA的纯度为A₂₆₀/A₂₈₀=1.88，含量为19.72 μg，说明总RNA和mRNA纯度较高，含量也较高，可用于合成cDNA。经噬菌斑测定，构建的鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库原始滴度为1.2×10⁴ pfu/mL，扩增后文库滴度为1.9×10⁹ pfu/mL。随机挑选24个噬菌斑进行PCR鉴定，结果显示，文库重组率为91.7%，重组体中插入片段大多在250-1000 bp ()，说明鸡DT40细胞cDNA分级纯化效果较好。随机选取12个PCR产物进行测序，结果显示插入序列均为鸡源序列，表明文库质量较好，能够满足文库筛选的需求。

用BP5-BSA对鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库进行三轮生物淘选。三轮筛选中，每轮投入的噬菌体滴度固定为1×10⁹ pfu/mL，而洗脱回收的噬菌体滴度和产出投入比逐轮提高 ()，表明筛选后与BP5特异性结合的噬菌体得到明显富集。随机挑取第三轮筛选后的噬菌体20个克隆，取其裂解液进行PCR鉴定，结果显示，第三轮筛选后噬菌体中的cDNA插入片段大小不等 ()。经序列测定，将噬菌体克隆插入的DNA序列与GenBank数据库 (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST) 进行同源序列比对，结果显示分别与3条鸡源基因同源，为血管内皮生长因子A (VEGFA,vascular endothelial growth factor A)、细胞周期蛋白E1 (CCNE1,cyclin E1) 和运输蛋白颗粒复合体2 (TRAPPC2,trafficking protein particle complex 2)。

分析BP5诱导鸡DT40细胞的mRNA差异基因表达谱，结果显示，BP5诱导鸡DT40细胞差异表达的基因有1078个(Fold change≥2.0)，其中上调基因有537个，下调基因有541个，BP5调节差异基因的表达，推测BP5可能参与多种生物学过程。BP5诱导鸡DT40细胞差异表达基因GO分析显示，BP5刺激组鸡DT40细胞被GO数据库注释的有795个差异基因，而Biological Process有237个差异基因，主要参与胸腺的发育、细胞发育的调节、细胞周期调控、细胞因子产生、蛋白质酪氨酸磷酸化的调节、蛋白激酶级联、泛素依赖性蛋白的降解、JAK2激酶的激活、信号转导通路的调节等生物过程 ()。利用KEGG数据库对BP5诱导鸡DT40细胞的差异表达基因进行Pathway分析，结果显示，BP5刺激组差异基因调节25个通路中多条通路与免疫调节和抗肿瘤功能有关，其中与抗肿瘤相关的通路有Notch信号通路、TGF-beta信号通路、凋亡、mTOR信号通路、p53信号通路 ()。差异表达的基因中与免疫相关的主要有MAPK11、JAK2、IL6ST、JARID2、SRC、TYR、RPS6KA2、MAPK14、FAT4等 ()，与抗肿瘤相关的主要差异表达基因有USP25、USP38、PSEN2、ANAPC2、USP45、BRCA1、SIAH1、CHEK2、TP53、CCNE1、CIP1等 ()，表明BP5可能参与T细胞和B细胞介导的免疫应答、细胞因子产生及抗肿瘤等生物过程。其中p53信号通路涉及的差异表达基因有SIAH1、CHEK2、TP53 (p53)、CCNE1、CIP1 (p21)，其中SIAH1、TP53、CIP1被上调，CHEK2、CCNE1被下调。结合相互作用蛋白筛选结果，提示BP5可能通过p53信号通路途径发挥抗肿瘤生物学功能。

以GAPDH基因为内参，用实时荧光定量PCR技术对以下10个基因进行检测：SIAH1、CHEK2、TP53、CCNE1、CIP1、CHUK、BIRC2、PRKX、CACNA2D2、NRK，其中SIAH1、CHEK2、TP53、CCNE1、CIP1涉及p53信号通路。RT-PCR结果显示，BP5刺激后，SIAH1、CHUK、PRKX、CACNA2D2、TP53和CIP1基因mRNA表达被上调，CHEK2、CCNE1、BIRC2和NRK基因mRNA表达被下调，RT-PCR结果与基因芯片分析结果相符 ()。

为进一步研究BP5是否是通过p53信号通路途径发挥抗肿瘤作用，以BP5诱导用荧光素酶标记的p53-Luc质粒转染HCT116细胞来研究BP5对p53 Luciferase活性的影响。结果显示，BP5在0.2-20 μg/mL浓度下能够明显提高被转染的HCT116细胞中p53相对Luciferase活性，而未转染的HCT116细胞中p53相对荧光素酶活性无明显变化，表明BP5在实验浓度下能够诱导p53转录活性 (-)。为进一步研究BP5对p53活性的影响，用p53通路特异性抑制剂α-pifithrin刺激被转染的HCT116细胞2 h，然后用20 μg/mL BP5刺激22 h，结果显示，α-pifithrin能够明显抑制BP5诱导的p53 Luciferase活性，表明BP5能够直接激活p53转录 (-)。

为进一步明确BP5对p53通路中相关蛋白表达的作用，用0.2-20 μg/mL的BP5刺激HCT116细胞，检测p53、p21、CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平。结果显示，BP5诱导能显著提高HCT116细胞中p53、p21蛋白的表达水平，而CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平明显降低 ()。表明BP5能够激活p53的转录，并调节p53通路中相关蛋白的表达。结合相互作用蛋白筛选及BP5诱导的鸡DT40细胞基因表达谱分析结果，表明BP5通过p53信号通路途径发挥其抗肿瘤生物学功能。

BP5是2011年从鸡BF中分离得到的一种新型法氏囊活性五肽，具有多种生物学活性，如免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等^{[, , ]}。目前，国内外学者对BP5的生物学功能及其作用机理方面的研究甚少，尤其是对抗肿瘤分子机制方面的研究几乎是空白，尚需更深入的研究。本研究旨在采用T7噬菌体展示技术筛选BP5鸡DT40细胞 (鸡淋巴瘤细胞) 相互作用蛋白，结合cDNA基因芯片技术获得BP5刺激鸡DT40细胞后与其抗肿瘤功能相关的主要差异表达基因，并通过检测BP5对p53 Luciferase活性和p53信号通路中相关蛋白表达的影响，揭示BP5发挥抗肿瘤功能的作用机制。

以噬菌体展示技术构建的cDNA表达文库由于具有容量大、易于进行生物淘选、能特异性地富集和分离到含有目标基因的噬菌体等特点 ^[]，在相互作用蛋白的筛选中得以广泛应用，如HCV核心蛋白相互作用蛋白 ^[]、乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白 ^[]等的筛选。本研究以BP5-BSA为靶分子对构建的鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库进行筛选，最终得到3个BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白，为VEGFA、CCNE1和TRAPPC2。其中VEGFA主要参与细胞周期、血管生成及细胞增殖等生物过程的调控，TRAPPC2主要参与转录、DNA依赖及运输过程，而CCNE1则主要参与细胞周期的调控。已有研究证实CCNE1是参与细胞周期G1/S转换的重要调节因子，可在G1晚期及S早期与CDK₂结合形成cyclin E1/CDK₂复合物，导致其底物蛋白视网膜母细胞瘤蛋白pRb等磷酸化，释放出激活的游离转录因子E2F，促进细胞周期从G1期进入S期^[]。pRb有低磷酸化和磷酸化两种状态，低磷酸化的pRb可与E2F结合并阻止cyclin E基因转录表达，从而使细胞阻滞于G1期，抑制细胞生长 ^[]。本研究通过鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库筛选到BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白CCNE1，表明CCNE1可能与BP5抗鸡DT40细胞增殖相关。

为了进一步探讨BP5发挥抗肿瘤作用可能的机制，本研究以BP5刺激鸡DT40细胞，通过基因芯片技术来分析BP5刺激后鸡DT40细胞基因表达谱的变化，从而获得与BP5抗肿瘤功能相关的重要信号功能基因和信号通路。基因芯片技术是一种可在较短时间内获得大量差异表达基因信息的大规模、高通量筛选技术，是目前基因研究方面最先进、最有效的方法之一，广泛应用于生命科学研究领域。本研究发现BP5刺激组差异基因调节的通路中有Notch信号通路、TGF-beta信号通路、凋亡、mTOR信号通路、p53信号通路等多条通路与抗肿瘤功能有关，其中与抗肿瘤相关的差异表达基因主要有USP25、USP38、PSEN2、ANAPC2、USP45、BRCA1、SIAH1、CHEK2、TP53、CCNE1、CIP1，而p53信号通路中涉及的差异表达基因有SIAH1、CHEK2、TP53 (p53)、CCNE1、CIP1 (p21)，其中SIAH1、TP53、CIP1被上调，CHEK2、CCNE1被下调。p53信号通路中涉及的5个差异基因均与细胞周期的调控或抗肿瘤有着密切联系。CHEK2 (细胞周期检测点激酶2) 是DNA断裂损伤中重要的信号转导蛋白，参与细胞周期G1、S期的阻滞，促进细胞对损伤进行修复。有研究证实，当细胞在G1期发生DNA损伤时，可激活CHEK2激酶使其磷酸化，活化的CHEK2又可引起p53磷酸化，从而发挥其作为转录激活因子的功能，启动p21基因的转录 ^[]。p21是p53的下游效应因子，其转录受p53的正调控，当p53过表达时可促进p21的表达从而抑制细胞增殖 ^[]。另外，p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，与细胞周期的调控密切相关，可通过与cyclin E/CDK₂复合物结合形成三聚体来抑制G1期cyclin E/CDK₂复合物的激酶活性，从而使细胞周期阻滞于G1期 ^[]。本研究BP5诱导鸡DT40细胞的mRNA基因表达谱分析结果显示，BP5调节的p53信号通路中CHEK2基因表达被下调，p53和p21基因表达被上调，CCNE1基因表达被下调，结合相互作用蛋白筛选结果，提示BP5可能通过p53信号通路途径导致细胞周期阻滞而发挥抗肿瘤生物学功能。另外，据报道，p53被激活以后还可使SIAH1基因的表达上调，而SIAH1的过度表达又能抑制肿瘤发生^[]。本研究发现BP5刺激后p53基因和SIAH1基因表达均被上调，进一步表明BP5引起鸡DT40细胞增殖抑制可能是通过p53信号通路途径发挥作用的。以上结果提示BP5可能通过p53信号通路途径发挥抗肿瘤生物学功能。

同时，BP5刺激后鸡DT40细胞基因表达谱的GO分析结果显示，BP5调节的差异基因主要参与胸腺的发育、细胞发育的调节、细胞因子产生、蛋白质酪氨酸磷酸化的调节、蛋白激酶级联、泛素依赖性蛋白的降解、JAK2激酶的激活、信号转导通路的调节等生物过程。Pathway分析结果显示，BP5调控RIG-I样受体通路、粘着连接、细胞间黏附分子、Jak-STAT信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、IgA产生的肠道免疫网络等多条与免疫相关的通路。这些结果中产生的信息为今后实验提供了重要的转录水平的参考依据，同时揭示BP5具有多种生物学功能，在细胞内多种信号中均发挥作用，为BP5发挥生物学功能的作用机制研究提供了参考依据。

众所周知，抑癌基因p53在细胞周期调控、细胞凋亡诱导等过程中发挥着重要作用，主要在转录水平上通过调控编码细胞生长和凋亡过程中的关键因子来抑制肿瘤的发生 ^[]。为进一步研究BP5抗肿瘤作用机制，本研究以BP5刺激转染荧光素酶标记的p53-Luc质粒的HCT116细胞，检测细胞中p53 Luciferase活性和p53通路中相关蛋白p53、p21、CCNE1和CHEK2蛋白表达水平的变化，结果发现，BP5在0.2-20 μg/mL浓度下能够明显提高被转染的HCT116细胞中p53相对Luciferase活性，而未转染的HCT116细胞中相对Luciferase活性无明显变化，且添加p53通路特异性抑制剂α-pifithrin的BP5诱导组HCT116细胞中相对Luciferase活性也无明显变化，这就表明BP5在实验浓度下能够激活p53的转录活性。检测BP5刺激的HCT116细胞中p53、p21、CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平发现，BP5诱导能显著提高HCT116细胞中p53、p21蛋白的表达水平，而CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平明显降低。表明BP5能够激活p53的转录，并调节p53通路中相关蛋白的表达。结合相互作用蛋白筛选及BP5诱导的鸡DT40细胞基因表达谱分析结果，进一步证实了BP5通过p53信号通路途径发挥其抗肿瘤生物学功能，为更深入地研究BP5抗肿瘤具体的分子机制奠定了基础。